rt-pcr是什么意思

RTPCR，反转录·聚合酶链反应是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

rt-pcr影响因素

RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。

1、建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。

2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。

rt-pcr操作步骤

1、从RNA(或mRNA)反转录合成cDNA第一链：

2、于95℃加热5～10min，灭活反转录酶，使RNA—cDNA杂交体变性，然后迅速冰浴冷却：

3、PCR扩增：方法基本同PCR。

cDNA第一链合成方法：20ul反应液中含10xPCR扩增缓冲液，2ul;四种dNTP(10 mmol/L)2ul;RNA酶抑制剂20U;mRNA，l～2ug(或RNA 5-10ug);AMV，20U;引物，1u;最后用灭菌水补至20ul。 以上溶液充分混匀后，于42℃反应60min，反应完毕后将反应管在95℃下加热5min，使反转录酶失活和RNA—cDNA杂合物变性。其后反应液则可置于-20℃下保存备用。